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必威app官网实验常见问题与解决方案

作者:天驰生物 日期:2013-07-25 17:02:39 信息来源:http://www.tianchibio.com/

必威app官网实验常见问题与解决方案

 

1.如何测定引物的OD值?
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。
举例:您拿到一管干粉的DNA,用1ml水溶解成母液,取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25,说明该50μL中含有0.25OD的DNA,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

 

2.怎样溶解引物?
我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。

 

3.合成的引物应如何保存?
没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10 pmol/ml或20 pmol/ml)后进行实验。

 

4.如何检测引物的纯度?
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。

 

5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?
没有,5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化的费用。

 

6.合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办?
PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。
1) 引物和模板是否配对,同源性有多大?
2) 引物本身是否有立体结构.
3) PCR反应用试剂是否能正常工作?
4) PCR仪是否工作正常?
5) PCR反应条件是否合适?
如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。

 

7.测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8,引物的纯度合格吗?
由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同, 例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.

 

8.如何将两条互补的单链退火形成双链?
用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反应? 一般来讲,20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。 15.引物在常温下运输,会降解吗? 不会降解,干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天,所以您收到的引物不会降解。 EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合,总体积不要超过500微升,加热到95℃ 2mins,然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。

 

9.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的引物,发现有很多条泳带,为什么?
对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。


10.能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?
不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

 

11.2OD的引物可以多少做次PCR反应?
一般来讲,20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。


12.引物在常温下运输,会降解吗?
不会降解,干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天,所以您收到的引物不会降解。

 

13: 合成的荧光标记探针应如何保存?
1.荧光探针必须避光保存。
2.干品请于-20℃保存。
3.强烈建议用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探针,这样得到的探针溶液更稳定,保存时间更长。通常,将探针配制成100 pmol/ul的储备液,分装成几份 (避免反复冻融),于-20℃保存。使用前,将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul),剩余部分于-20℃保存。

 

14: 进行PAGE电泳时,长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?
1.A、G、C、T的组份不同,电泳速度不同;
2.DNA的立体结构不同,电泳速度不同。 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生,长链Oligo DNA之间差别较小。

 

15: PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,为什么?
如果测序后引物处出现了问题,不排除PCR错配的可能,但更主要的原因应在合成引物本身。在引物合成过程中,除了人为将序列输错 (可核对合成报告单),化学合成方法本身不可避免地会产生失败序列,具体分析如下:
1.由于DNA合成是从3′→5′端一个碱基一个碱基地连接上去的,每连接上一个碱基,都需要多步化学反应 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation),我们称之为一个循环。Coupling是上一个碱基的5′OH 与下一个碱基的3′活性部分发生偶联反应,该反应的效率最高可达99%,即便如此,仍有1%的序列不能连接下一个碱基,这些序列在经过Capping后脱离循环,成为缺碱基的失败序列;
2.Capping是将没有连接上下一个碱基的5′-OH乙酰化,阻止其进一步延伸。Capping的效率不可能达到100%,没有被Cap的5′OH会进一步发生反应,造成中间缺碱基的失败序列;
3.Detritylation是将上一个碱基5′OH上的保护基脱掉,准备连接下一个新碱基,脱保护的效率也很难达到100%,没有脱保护的5′OH会跳过该循环而直接进入下一个循环,造成中间缺碱基的失败序列;
4.在Coupling步骤中,新碱基(活性状态)在没有与上一个碱基发生偶联反应前发生自身连接,造成多碱基的失败序列;
5.合成时碱基G可能会转化成烯醇式异构体,PCR扩增时被DNA聚合酶识别作A,发生 G到A的转换。
上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。对40 mer以下的DNA制品,HPLC是最好的纯化方法,其次是PAGE;而对40 mer以上的DNA制品PAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。所以,如您要对PCR产物克隆后测序,一定要选择PAGE纯化或HPLC纯化的引物。

 

16: PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,怎么办?
1.因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。
2.如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物。

 

17: 进行蛋白表达实验数个月不成功,后经测序发现引物处有错误,怎么办?
1.表达实验之前一定要对DNA序列进行验证。
2.我们可以免费重新合成引物。
3.如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。

 

18: G到A的转换。 上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。对40 怎样才能保证Oligo DNA的正确性?
1.合成Oligo DNA时,选用高纯度级制品。
2.避免使用过长的Oligo DNA,最好选用小于35 mer的合成DNA制品。
3.进行克隆实验时,每次克隆都须进行测序验证,以保证序列的正确性,然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时,尤其需要注意。

 

19: 平端的PCR产物难以克隆,为什么?
由于一般的PCR用引物的5′末端都没有磷酸基团,因此,扩增后的PCR产物的5′末端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时,无法克隆进去;而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时,背景会极高。此时请对PCR产物的5′端进行磷酸 (PO4修饰) 化处理。

 

20: 进行反义核酸实验时,是否要对DNA链全部进行S代修饰,除了S代外,还有什么办法可增加核酸在生物体内的稳定性?
DNA经S代修饰后比较稳定,在细胞中不会被核酸酶降解。如果整条链全部S代,的确能增加DNA的稳定性,但会降低其Tm值,也即降低该反义DNA与靶序列的结合效率。因此,科研人员一般采用将DNA片段两端插入数个(通常3个)S代磷酯键Phosphorothioated Bonds),这样既能增加DNA的稳定性,又能增加反义DNA与靶序列的结合能力。不过如果要将反义DNA注入到活的动物体内,为增强稳定性,还是将整条链S代效果更好。
2’ O-Me (2’-OMe-RNA与RNA的亲和力要比DNA与RNA的亲和力大很多)。 此外,5-Me-dC由于能增强DNA双螺旋的稳定性,有时也被掺入到S代的反义核酸中。 RNA也阻抗核酸酶降解,可与S代DNA构成嵌合的反义核酸,这样既能增强反义核酸的稳定性,又能增加其与靶序列的亲和性 (2’-OMe-RNA与RNA的亲和力要比DNA与RNA的亲和力大很多)。
此外,5-Me-dC由于能增强DNA双螺旋的稳定性,有时也被掺入到S代的反义核酸中。

 

21: FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别?
它们皆是荧光素标记 (Fluorescein),三者结构间的区别如下:
从结构图可见,5-FAM与6-FAM互为异构体;而FITC则在与Oligo的连接方式上(硫脲键) 有别于前者(酰胺键),但它们的发色团均为荧光素,通常使用中没有区别。

 

22: 淬灭基团为TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同?
由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes),或称"TaqMan"探针,用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图),作为淬灭基团使用时的特点也不同,现说明如下:
1.TAMRA为荧光染料,在淬灭报告基团的同时,自身会在更高波长处发射荧光,此发射荧光会对报告基团的检测造成影响,探针荧光本底 (Background)相对较高。而Eclipse及BHQ系列为非荧光染料,淬灭报告基团,但自身不发射荧光,因此,探针荧光本底低,信噪比更大,检测灵敏度更高。
2.淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱迭盖(Overlapping),也即报告基团的荧光光谱应与淬灭基团的吸收光谱相交搭。对比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光谱,可见TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄,可与之匹配的报告基团种类比较少;而Eclipse则具有更宽的吸收范围(390 nm-625 nm),可淬灭的报告基团种类很多,如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可;组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广,从430 nm一直到近红外,可淬灭的报告基团种类更多 (象Cy3、Cy5等的淬灭效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

 

23: TaqMan 探针设计时应遵循哪些原则?
1.探针应位于两引物之间;
2.探针中碱基G、C的含量应在20%~80%之间;
3.避免同种碱基成串出现,特别是碱基“G”;
4.碱基G不要出现在5’末端;
5.探针的Tm值要比引物的Tm值高8~10℃,应在68~70℃之间;
6.探针长度超过30个碱基时,最好把淬灭基团放在中间,以防止荧光本底过高,这时探针的3’末端应加磷酸基封阻,以防探针在PCR反应过程中延伸。

 

24: 何谓分子信标 (Molecular Probes)?与普通的双标记探针 (如TaqMan探针)相比,在使用上有什么特殊性?
Molecular Probes是一类特殊的双标记探针,通常状态下,其两末端互补配对,形成茎-环结构 (发卡环结构),发卡环结构迫使分别连在两末端的报告基团与淬灭基团紧密邻近 (此时检测不到荧光),而一旦杂交到靶序列上,则报告基团与淬灭基团分开,Molecular Probes变得明亮起来,可检测到荧光。由于发卡环结构的存在,探针对靶序列检测的特异性增强,相对于普通的双标记探针 (如TaqMan探针),Molecular Probes对SNP有更强的识别能力,能区分序列上仅相差一个碱基的靶序列,因此Molecular Probes常用于SNP检测。此外,Molecular Probes也应用于活体细胞内的mRNA杂交、RNA加工、及转录过程的时时监测研究等。

 

本文地址:http://www.tianchibio.com/cnews/403.html

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