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细胞生物学实验常用试剂、培养基的配制

作者:天驰生物 日期:2014-12-09 9:29:18 信息来源:http://www.tianchibio.com/

一、动物细胞原代和传代培养

(一)培养液的配制

蒸馏水必须是新鲜的三蒸水。选用RPMI 1640培养液。

1.配1升RPMI1640培养液的粉末(1袋)+2gNaHCO3

2.溶于800mL三蒸水中充分搅匀

3.用HCl调节PH7.2-7.4

4.用蒸馏水补足1L

5.用灭菌滤器过滤(用φ0.45或0.20μm滤膜)

6.用灭菌瓶分装(学生实验)100ml/瓶

(二)磷酸盐缓冲液(PBS)的配制

pH
 7.6
 7.4
 7.2
 7.0
 
H2O

NaCl

Na2HPO4

NaH2PO4
 1000

8.5

2.2

0.1
 1000

8.5

2.2

0.2
 1000

8.5

2.2

0.3
 100mL

8.5g

2.2g

0.4g
(三)7.4% (W/V)  NaHCO3

(四)10000 IU / ml硫酸链霉素、青霉素G钾盐的配制

硫酸链霉素             1g

青霉素G钾盐     100万 国际单位(IU)

将上述两种药品溶于100mL生理盐水中,然后灭菌(过0.45μm的滤膜),分装于青霉素瓶中放-20℃保存。使用时可按100 IU/mL稀释。

(五)0.05%胰蛋白酶溶液的配制

1.      1g胰蛋白酶加入20mLPBS中

2.      37℃搅拌2小时

3.      4℃7000rpm离心20min 

4.      取上清灭菌(过0.45μm的滤膜)

5.      每10mL分装,放-20℃保存

6.      取10mL冻存的加入灭菌的PBS1L中,2%的EDTA(灭过菌的)10mL

7.      配成终浓度0.05%的胰蛋白酶

(六)0.3%台盼兰染液

      称取台盼兰(Trypan blue)粉0.3克,溶于100mL生理盐水中,加热使之完全溶解,用滤纸过滤除渣,装入瓶内室温保存。

(七)洗液

方法:先将重铬酸钾完全溶解于水中,如不溶可加热帮助溶解,然后缓慢加入浓硫酸。加浓硫酸时将产生大量热量,因此配制的容器宜用陶瓷,加入浓硫酸时要缓慢而不能过急,以免热量产生太多,导致容器破裂,发生危险。

次强液:重铬酸钾120g           强液: 重铬酸钾63g

               浓硫酸 200mL                    浓硫酸1000mL

               蒸馏水1000mL                   蒸馏水 200mL

 

二、脂类染色

10%中性福尔马林      甲醛      100mL     磷酸二氢钠    6.5g

                                           蒸馏水  900mL

苏丹Ⅲ染液               苏丹Ⅲ  0.1g       95%酒精       20mL

苏丹黑染液               苏丹黑  0.5g       70%酒精      100mL
 

三、石蜡切片

      卡诺氏固定液            100%酒精  3份     冰醋酸  1份

      埃利希苏木精染液    苏木精      1.0g       乙醇       50mL  

                                          醋酸          5mL       甘油       50mL

                                          硫酸铝钾  5g           蒸馏水   50mL

      将苏木精溶于15mL的乙醇中,再加醋酸并搅拌,以加速其溶解。当苏木精溶解后将甘油加入并摇动容器,同时加入其余的乙醇;硫酸铝钾需研磨并加热,然后溶解于蒸馏水中,将其一滴滴地加入上边的溶液,并不断摇动,此液配好后,将瓶口用纱布盖好,置通风处,经常摇动以加速其成熟,成熟约需4周左右,成熟的染液为深红色。

      1%伊红酒精溶液      伊红      1.0g      95%酒精    100mL

      1%盐酸酒精溶液      盐酸      1 份      70%酒精     100份

      郝普特氏粘片剂     明胶      1.0g      蒸馏水         100mL

                                          石炭酸   2.0g      甘油             15mL

      配制时明胶溶解于30℃的蒸馏水中(水浴锅中进行),溶解后加入石炭酸和甘油,搅拌均匀过滤,贮存于玻璃瓶中.

1%番红染液         番红     1.0g       蒸馏水  100mL

1%固绿染液       固绿     1.0g       蒸馏水  100mL

 

四、PAS反应

      1%过碘酸                   过碘酸   1.0g        蒸馏水  100mL

      1 mol/L(V/V)HCl            浓盐酸   8.5mL     蒸馏水  91.5mL

0.5%偏重亚硫酸钠溶液   偏重亚硫酸钠  0.5g  蒸馏水  100mL

      Schiff试剂          蒸馏水100mL煮沸后取下,立即放入碱性品红1g使之溶解。冷却至50℃时用滤纸过滤。加偏重亚硫酸纳(或钾)(或亚硫酸氢盐)2g及1mol/L HCl 20mL。避光放置18~24h(室温)。溶液变为草黄色。然后加入300mg活性炭,用力摇动1min,过滤。过滤后即得无色品红。

     此液配就后,封严瓶塞,外包黑纸,贮于4℃冰箱备用,用前升至室温。

 

五、核酸的细胞化学(Feulgen反应)

     1mol/LHCl          浓盐酸   8.5mL     蒸馏水  91.5mL

      1%亮绿染液        亮绿       1g             蒸馏水  100mL

      Schiff试剂         蒸馏水100mL煮沸后取下,立即放入碱性品红1g使之溶解。冷却至50℃时用滤纸过滤。加偏重亚硫酸纳(或钾)(或亚硫酸氢盐)2g及1mol/L HCl 20mL。避光放置18~24h(室温)。溶液变为草黄色。然后加入300mg活性炭,用力摇动1min,过滤。过滤后即得无色品红。

      此液配就后,封严瓶塞,外包黑纸,贮于4℃冰箱备用,用前升至室温。
 

六、液泡系及线粒体的活体染色

Ringer溶液          氯化钠             0.85g(变温动物用0.65g)

                                氯化钾             0.25g

                                 氯化钙             0.03g

                                蒸馏水             100mL

1%的1/5000詹姆斯绿B溶液称取50mg詹姆斯绿B溶于50mLRinger溶液混匀,稍加 热(30~40℃)使之溶解,用滤纸过滤,即为1%原液。取1%原液1mL加入49mLRinger溶液,即成1/5000工作液。将其装入瓶中备用 。最好现用现配 ,以保持  它的充分氧化能力。

1%的1/3000中性红溶液    称取0.5g中性红溶液溶于50mLRinger液,稍加热(30~40℃)使之很快溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶于暗处保存。临用前,取已配制的1%中性红溶液1mL加入29mLRinger溶液混匀,装入棕色瓶备用。

 

七、细胞融合

Alsever溶液:       葡萄糖2.05g,柠檬酸钠0.80g,NaCl 0.42g,

                                     溶于100mL双蒸水中。

GKN溶液:           NaCl 8g,KCl 0.4g,Na2HPO4·2H2O 1.77g,

                                      NaH2PO4·H2O 0.69g,葡萄糖2g,酚红0.01g,

                                     溶于1000mL水中。

50%PEG溶液:    称取一定量的PEG(WM=4000)放入烧杯中,沸水浴加热,使之熔化,待冷却至50℃时,加入等体积预热至50℃的GKN溶液,混匀,置37℃备用。

 

本文地址:http://www.tianchibio.com/bnews/469.html

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